中檢維康iELisaT-2毒素檢測試劑盒
- 概要
T2毒素(T2)是由多(duo)種鐮刀菌(jun)產生的一種霉菌(jun)毒素。主要污染小麥、大(da)麥、玉米等糧食(shi)作物及其制品,對人類健康及畜牧(mu)業構成了較大(da)危害。T-2毒素(su)主(zhu)要影響血液,肝臟(zang),腎臟(zang),胰腺肌肉及淋巴細(xi)胞的功能,T-2毒素中毒后的一般臨床癥(zheng)狀為厭食、嘔(ou)吐(tu)、腹瀉(xie)、生長(chang)停(ting)滯、繁(fan)殖和神經機(ji)能障礙等(deng)。使(shi)用T2毒(du)素試(shi)劑盒則能夠(gou)快速而準(zhun)確的分析樣品中T2毒素殘留。
- 原理
測定的基礎是抗原(yuan)-抗體反(fan)應。微孔板上包被有偶聯抗原。分別加入T2毒素標(biao)準品(pin)或樣(yang)品(pin)、酶標(biao)記物和(he)抗體于微孔中,樣(yang)品(pin)/標準(zhun)品競爭(zheng)結合抗(kang)(kang)體,酶標記物可與(yu)一(yi)抗(kang)(kang)結合,再(zai)于酶標版上的包被抗(kang)(kang)原結合。反(fan)應洗(xi)滌(di)后,加入TMB底物顯藍色,加(jia)入(ru)終止液后顏色由(you)藍變黃,用酶標儀(yi)在(zai)450nm處檢測,吸光(guang)值與(yu)樣品中T2毒素含量成負相關,與(yu)標準曲線比(bi)較即可得出T2毒素的(de)含量(liang)。
- 試劑(ji)盒的組(zu)成
- 包被有抗(kang)原的96微孔(kong)板:1塊(96 孔,12條(tiao)×8 孔)
- T2毒素(su)標準品:0ng/mL、0.5ng/mL、 1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL 1 瓶(ping) × 1.0mL
- T2抗體(ti) 1瓶 ×10mL
- 酶標記物(wu) 1 瓶 ×10mL
- 10× 濃縮洗滌液: 1瓶 × 50mL
- T2稀釋緩沖液A: 1瓶 × 50mL
- T2稀釋(shi)緩沖液B: 1瓶 × 50mL
- 顯色底物(wu)TMB: 1瓶 × 17mL
- 終止液: 1瓶 × 7mL
- 試劑盒說明書: 1份
- 質檢(jian)報告: 1份
- 需要的儀器(qi)、試劑
1)儀器
- 酶(mei)標儀(yi)450nm(iELisa全自動酶標儀(yi)或相當者)
- 微量移液(ye)器:20μL-200μL單道,100μL-1000μL單(dan)道, 50μL-300μL八道
- 多(duo)功(gong)能旋轉混合器(或者搖(yao)床、高速均質(zhi)器)
- 酶(mei)標(biao)板振蕩器
- 渦(wo)旋混合器
- 50mL離心管(guan)
- 1.5mL離心管
- 定(ding)性濾紙
- 過濾漏斗
- —天平:感量0.01g
- 試劑
- 樣品提取(qu)液70%甲醇:取700mL甲醇,加300mL純(chun)水,混勻。
- 樣品(pin)處理
5.1谷物(玉(yu)米、小麥、高粱(liang)、大(da)米、大(da)豆):
- 稱(cheng)取5.0g粉碎樣品于50mL離心管中,加(jia)入25.0mL樣品提取液70%甲醇,置于多功能旋轉混(hun)合器上振蕩30分鐘(或使用高速均(jun)質(zhi)器均(jun)質(zhi)3分鐘,或搖床上振蕩(dang)40分鐘)。
- 將提取(qu)液用普通濾紙過濾,吸(xi)取100μL濾液置于1.5mL離心管中(zhong),加入900μL T2稀釋緩沖(chong)液A,用渦旋混合器混勻。
稀釋倍數:50
5.2飼(si)料:
- 稱(cheng)取5.0g粉碎樣品于50mL離(li)心管(guan)中(zhong),加入25.0mL樣品提取液(ye)70%甲醇(chun),置于多功能旋轉混(hun)合器上振(zhen)蕩30分(fen)鐘(或使用高速(su)均質器均質3分鐘,或搖床上振蕩(dang)40分鐘)。
- 將(jiang)提取液用(yong)普通濾紙過(guo)濾,用(yong)0.22μm有機系濾(lv)膜(mo)過濾(lv)后(hou),取100μL濾液置于(yu)1.5mL離心管中,加入900uL T2稀釋緩沖(chong)液(ye)B,用渦(wo)旋混(hun)合器混(hun)勻。
稀釋倍數:50
6. 酶聯免疫(yi)分析程(cheng)序
6.1測定之前注(zhu)意事項
- 使用(yong)前(qian)將所(suo)有試劑平衡至室溫(20-25℃)。
- 使用后迅速將(jiang)試劑(ji)放入2-8℃冷藏。
- 在ELISA分(fen)析中的(de)(de)再(zai)現性(xing)(xing),很大程度上取決于洗(xi)板(ban)(ban)的(de)(de)一致性(xing)(xing),正(zheng)確(que)的(de)(de)洗(xi)板(ban)(ban)操作(zuo)是(shi)ELISA測(ce)定程序中(zhong)的要點。
- 所有溫育(yu)過程應避免陽光直射(she),并按要求用(yong)蓋板覆蓋住酶標板。
6.2溶液的配制(zhi)
- 提取(qu)液(ye)的(de)配(pei)制: 根據實驗所需的量(liang)配(pei)制70%的甲醇(chun)水(shui)溶液(水(shui)要用(yong)純水(shui)、或蒸餾水(shui)、去離子水(shui))
- 洗滌液的配制:將(jiang)濃(nong)縮洗滌液用純(chun)水(shui)稀釋10倍后使用。(例(li)如:取10 mL 濃縮(suo)液+90 mL純水(shui), 可以用于32孔的檢測)。
6.3測(ce)定程序
- 將足夠標準品(pin)(pin)和樣(yang)品(pin)(pin)所用數(shu)量的(de)孔條(tiao)插入酶(mei)標板(ban)架,標準品(pin)(pin)和樣(yang)品(pin)(pin)做兩個平行(xing)實(shi)驗,記錄下(xia)標準和樣(yang)品(pin)(pin)的(de)位(wei)置(zhi)。未使用的(de)酶(mei)標板(ban)用鋁箔袋(dai)封(feng)好置(zhi)2-8℃冷藏保存(cun)。
- 分別吸取50μL標準品和(he)樣品加至相應的微孔(kong)(雙孔(kong))中(zhong),然后(hou)再各加入50μL的(de)酶標記物,后加入50μL的T2抗體(ti),裝(zhuang)入袋中密封,室(shi)溫(25℃)溫育20分(fen)鐘。
- 倒出孔(kong)中的液體(ti),每孔(kong)加入(ru)250μL稀釋好的洗(xi)滌(di)液洗(xi)滌(di),重復(fu)操(cao)作四次。洗(xi)板時每次間隔30s,洗完后用力(li)在吸(xi)水紙上排干。
- 每(mei)孔加入100μL顯色(se)底(di)物,避光(guang)室溫(wen)(25℃)溫育10分(fen)鐘。
- 每孔(kong)加入50μL終止液,混(hun)勻。
- 置于酶標儀中,振(zhen)蕩混勻(yun),在450nm處(chu)測定吸光(guang)度值(OD值),參比(bi)波長630nm。(iELisa全自動酶標儀可以直接讀出、打印濃度值)。
7. 結果判定(ding)
1)所獲得(de)的(de)每個濃度(du)標準(zhun)溶(rong)液和樣本吸光度(du)值(zhi)的(de)平均值(zhi)(B)除以(yi)DI個(ge)標準(zhun)(0標(biao)準)的吸光度值(zhi)(B<蘇b>0蘇b>)再乘以100%,即百分吸(xi)光度(du)值(zhi)。
百分吸(xi)光度值(%)= | B | ×100% |
B<蘇b>0蘇b> |
以(yi)T2毒素標準(zhun)品濃度值(zhi)(ppb)為X軸,百(bai)分吸(xi)光度(du)值為Y軸,繪(hui)制標準(zhun)曲線圖。相(xiang)對(dui)應(ying)每一個樣品(pin)的濃度(du)可以從標準(zhun)曲線上(shang)讀(du)出。也可以用回(hui)歸方程法,計算出樣本溶液濃度(du)。利用計算機(ji)專業軟(ruan)件,更(geng)便于大量樣品(pin)的快速分析。
- 樣(yang)品的實(shi)際濃度為讀數結果乘以(yi)相應稀釋倍(bei)數。
- 如(ru)果(guo)測(ce)(ce)定值(zhi)超出檢(jian)測(ce)(ce)范圍,樣品(pin)提取(qu)溶(rong)液按一(yi)定的比例用70%甲醇進行稀釋。
8. 注(zhu)意(yi)事項
- 室溫低于20℃或試劑及樣(yang)品(pin)未回到室溫(20- 25℃)會導致數值(zhi)偏(pian)低。
- 在洗板過程(cheng)中(zhong)如果出(chu)現板孔干燥過久的情況,則(ze)會出(chu)現標準曲線不(bu)成線性(xing),重(zhong)復(fu)性(xing)不(bu)好的現象。所(suo)以洗板排干后應立即(ji)進行下一步操作(zuo)。
- 標準物(wu)質和顯色液對光敏感,避免直接(jie)暴露在光線下。
- 混合(he)要均勻,洗板要*(包括加樣品和標準液的(de)時候都必需充分(fen)混合均勻)。
- 終止液(ye)為強酸性物質,避免接(jie)觸皮膚(fu)。
- 不(bu)要(yao)使用(yong)過了有效期(qi)的試(shi)劑盒,也不(bu)要(yao)混合使用(yong)不(bu)同批(pi)次的試(shi)劑盒,這樣(yang)會引起測(ce)定結果不(bu)準確(que)。
- 試(shi)劑盒的(de)儲存條(tiao)件是2-8℃,切勿冷凍(dong)。
9. 中檢維康iELisaT-2毒素檢測試劑盒的性能指(zhi)標
- 檢(jian)測限LOD: 谷(gu)物10ppb(μg/kg),飼料15ppb,(LOD:空白樣品測定值+2倍標準偏差(cha)SD)
- 定量限LOQ: 谷物25ppb,飼料(liao)30ppb。
- 定量檢(jian)測范圍:谷物25-1000ppb,飼料30-1000ppb。